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流式细胞仪结果图解读

变宝网04月17日讯

流式细胞仪结果图解读,流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参,并可以根据预选的参范围把指定的细胞亚群从中分选出来。

流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是:由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴,根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选,而后由充电电路对选定细胞液滴充电,带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转,落入收集器中;其它液体被当作废液抽吸掉,某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。

稳定的小液滴是由流动室上的压电晶体在几十KHz的电信号作用下发生振动而迫使液流均匀断裂而形成的。一般液滴间距约数百μm。实验经验公式f=v/4.5d给出形成稳定水滴的振荡信号频率。其中v是液流速度,d为喷孔直径。由此可知使用不同孔径的喷孔及改变液流速度,可能会改变分选效果。使分选的含细胞液滴在静电场中的偏转是由充电电路和偏转板共同完成的。充电电压一般选+150V,或-150V;偏转板间的电位差为数千伏。充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的,因此从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间,一般为数十ms。精确测定延迟时间是决定分选质的关键,仪器多采用移位寄存器数字电路来产生延迟。可根据具体要求予以适当调整。

(50)数据处理原理:FCM的数据处理主要包括数据的显示和分析,至于对仪器给出的结果如何解释则随所要解决的具体问题而定。

①数据显示:FCM的数据显示方式包括单参数直方图、二维点图、二维等高图、假三维图和列表模式等。

直方图是一维数据用作最多的图形显示形式,既可用于定性分析,又可用于定分析,形同一般X—Y平面描图仪给出的曲线。根据选择放大器类型不同,坐标可以是线性标度或对数标度,用“道数”来表示,实质上是所测的荧光或散射光的强度。坐标一般表示的是细胞的相对数。图10-2给出的是直方图形式。只能显示一个参数与细胞之间的关系是它的局限性。

二维点图能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。坐标和坐标分别为与细胞有关的两个独立参数,平面上每一个点表示同时具有相应坐标的细胞存在(图10-3)。可以由二维点图得到两个一维直方图,但是由于兼并现象存在,二维点图的信息要大于二个一维直方图的信息。所谓兼并就是说多个细胞具有相同的二维坐标在图上只表现为一个点,这样对细胞点密集的地方就难于显示它的精细结构。

 

图10-2  直方图 图10-3  二维点图

二维等高图类似于地图上的等高线表示法。它是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数,即“等高”。曲线层次越高所代表的细胞数愈多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的,因此等高线越密集则表示变化率越大,等高线越疏则表示变化平衡。图10-4给出了二维等高图的样式。

假三维图是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方法。它把原二维图中的隐坐标—细胞数同时显现,但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作,以便多方位的观察“山峰”和“谷地”的结构和细节 ,这无疑是有助于对数据进行分析的。图10-5为假三维图的示意图。

 

图10-4  二维等高图 图10-5  假三维图

列表模式其实只是多参数数据文件的一种计算机存贮方式,三个以上的参数数据显示是用多个直方图、二维图和假三维图来完成的。可用ListMode中的特殊技术,开窗或用游标调出相关部分再改变维数进行显示。例如,“一调二”就是在一维图上调出二维图来;“二调一”就是从二维图中调出一维图来。图10-6给出了从二维图等高图中调出相应窗口的直方图的示意图。

图10-6 从二维图设窗调出直方图示意

 流式细胞仪结果图解读

上面简要地介绍了几种数据显示形式,在实际应用中,可根据需要选择匹配,以便了解和获得尽可能多的有用信息。

②数据分析:数据分析的方法总的可分为参数方法和非参数方法两大类。当被检测的生物学系统能够用某种数学模型技术时则多使用参数方法。数学模型可以是一个方程或方程组,方程的参数产生所需要的信息来自所测的数据。例如在测定老鼠精子的DNA含时,可以获取细胞频数的尖锐波形分布。如果采用正态分布函数来描述这些数据,则参数即为面积、平均和标准偏差。方程的数据拟合则通常使用最小二乘法。而非参数分析法对测得到的分布形状不需要做任何假设,即采用无设定参数分析法。分析程序可以很简单,只需要直观观测频数分布;也可能很复杂,要对两个或多个直方图逐道地进行比较。

逐点描图(或用手工,或用描图仪、计算机系统)是大家常用的数据分析的重要手段。我们常可以用来了解数据的特性、寻找那些不曾预料的特异征兆、选择统计分析的模型、显示最终结果等。事实上,不经过先对数据进行直观观察分析就决不应该对这批数据进行数分析。从这一点来看,非参数分析是参数分析的基础。

逐道比较工作较大,但用直观法很容易发现明显的差异,特别是对照组和测试组。考虑到FCM的可靠性,要注意到对每组测,都要有对照组,对照组可以是空白对照组、阴性对照组、或零时刻对照组等,具体设置应根据整体实验要求而定。对照组和测试组的逐道比较往往可以减少许多不必要的误差和错误解释。顺便指出,进行比较时对曲线的总细胞数进行归一化处理,甚至对两条曲线逐道相减而得到“差结果曲线”往往是适宜的。

因为数据分析往往和结果解释关系十分密切,也就是说和生物学背景相关,因此具体的分析法和原理将在后面结合实例再介绍。

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